垂体肿瘤的MGMT的免疫组化中的争议

张南 （自媒体久久自媒体）

《Pituitary》杂志2019年9月30日在线揭橥希腊的KontogeorgosG,ThodouE,KoutourousiouM等撰写的临床研究《垂体肿瘤的甲基鸟嘌呤甲基转移酶免疫组化：具有临床意义的争议。MGMTimmunohistochemistryinpituitarytumors:controversieswithclinicalimplications.》（doi:10.1007/s11102-019-00993-5.）

对于常规治疗无效的进行性进袭性（aggressive）垂体腺瘤和垂体癌患者，替莫唑胺(TMZ)今朝被认为是一种合理的治疗方案。凭据DNA修复酶O-6甲基鸟嘌呤DNA转移酶(MGMT)的表达，替莫唑胺(TMZ)的给药可改善很多患者的临床回响和生存。低的或阴性的MGMT免疫回响性可展望TMZ治疗的回响性。是以，MGMT可作为选择预期治疗回响的候选患者的尺度。 （原文来自久久自媒体）

采用多种抗原修复方案（antigenretrievalprotocols），对25例Ki-67标记指数大于3%、且有p53表达的垂体腺瘤进行MGMT表达的研究。直策应用抗体后，只有一个腺瘤发生MGMT阳性。然而，在用抗原修复方案预处理组织切片后，又有3个腺瘤由最初的阴性转为阳性。

这些发现能够注释假阴性MGMT免疫组化患者对TMZ治疗缺乏回响。对肿瘤样本进行MGMT表达评估时，应郑重使用最佳免疫组化方案，以获得一致性和靠得住的究竟，，匡助识别或者对TMZ治疗发生回响的患者。

引言

垂体腺瘤在生齿中的发生率为1/1000-2000，尽管有一部门或者需要额外的放射治疗，用现代外科手术干涉和进步的药物治疗能够有效地掌握。固然大多数患者病程惰性（indolentcourse），一部门首要为大腺瘤，或者示意出进袭性行为，有早期的复发和进展，而约0.2%会酿成真正的恶性垂体肿瘤，伴有中枢神经系统和远处的转移。

在曩昔二十年中在垂体腺瘤的药物治疗治理方面取得了重猛进展。因为常规化疗显露的回响率低，而放射治疗则不克掌握肿瘤的生长，且伴有相当大的副感化，对这些临床难治的进袭性（refractoryaggressive）肿瘤的治疗仍具有挑战性。替莫唑胺(TMZ)是咪唑四嗪衍生物（imidazotetrazinederivative），按捺DNA复制的口服细胞毒性化疗药物。它最初用于治疗高度恶性胶质瘤，当用于治疗进袭性/恶性垂体肿瘤时能显著改善5年总体生存率和5年无进展生存率。这种药物今朝成为对常规治疗体式没有回响的肿瘤的合理治疗选择。替莫唑胺的细胞毒活性取决于O-6甲基鸟嘌呤DNA转移酶(MGMT)的表达，这是存在于肿瘤细胞中的DNA修复酶，会导致TMZ的失活。缺乏对MGMT的免疫回响性展望对治疗有回响性。此外,在从最初MGMT表达较低的有回响的患者中移除的肿瘤中，注重到存在MGMT表达降低或呈阴性，解说TMZ也有接收低MGMT存储的能力（capabletoabsorblowMGMTstores）。比拟之下，肿瘤显露有高MGMT表达的患者预期没有治疗结果，提醒TMZ给药应该局限于针对经选定的经由免疫组织化学评估肿瘤样本中MGMT表达等候有治疗的回响的病人。

尽管有大量的研究认为MGMT是使用TMZ治疗的患者的标记物，但其是否是TMZ治疗的最佳的展望生物标记物这仍然是一个有争议的话题。尽管最初的研究报道肿瘤的回响性与肿瘤的缺乏MGMT表达有较好的相关性，为TMZ给药治疗难治性（refractory）腺瘤提出了一个合理的方式，一部门垂体肿瘤MGMT阴性的患者对治疗无回响。对福尔马林-固定、石蜡包埋块（formalin-fixed,paraffin-embeddedareavailable）针对MGMT的特异性单克隆抗体免疫组化。然而，阴性的究竟并不老是能清扫MGMT的存在。这能够用能够战胜的几个手艺问题来注释，例如初始免疫回响阴性的或者在对组织切片使用抗原修复和谈预处理后变为阳性。是以，应该对各类和谈进行细心的测试而且尺度化，以选择最适合每个病理实验室。

本项研究，试图注释在正确选择使用TMZ治疗的候选患者时，组织化学和临床计较，并凸起病理学者的要害感化。

材料与方式

我们从希腊垂体肿瘤基准中心（theHellenicPituitaryTumorReferenceCenter）找到25例腺瘤，研究MGMT的表达情形。所有肿瘤均为大腺瘤，凭据Ki-67标记指数(LI)升高(3-30%)和p53有普遍表达，以前被归类为不典型腺瘤。个中包罗3例生长激素细胞腺瘤，6例泌乳素细胞腺瘤，1例夹杂生长激素细胞泌乳素细胞腺瘤，1例嗜酸细胞干细胞腺瘤，1例功能性促肾上腺皮质激素细胞腺瘤，1例促甲状腺激素腺瘤和12例促性腺激素腺瘤。从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取4组切片，使用培育的针对重组的MGMT卵白(..台北Abnova生产，1:100稀释)的小鼠特异性单克隆抗体MT3.1，进行MGMT免疫组化检测。在4°C下留宿进行一级抗体的孵育（Incubationswithprimaryantibody）。简略的（one-step）(丹麦Glostrup的DakoA/S生产的)EnVision聚合物检测系统作为(密苏里州圣路易斯市Sigma公司生产)氯化镍-DAB强化色素原（nickelchloride—DABenhancingchromogen）的二级环节（secondarylink）。

在第一组切片中，直策应用一级抗体。第二组切片，在室温下用1mg/100mlpronaseE（链霉卵白酶）(SigmaChemicalCompanies,St.Louis,MO,USA)预处理20分钟。在第三组切片中,在应用一级抗体之前,部门使用抗原修复系统采用在三羟甲基氨基甲烷（Tris）/EDTA缓冲液(pH值9.0)中加压蒸煮（pressure-cooking）20分钟。第四组切片,一级抗体被磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution）替代作为阴性对照组。内皮细胞核免疫染色为内部的阳性对照组。

究竟

在第一组切片中，仅在一例29岁的男性Ki-67标记指数（LI）为4%的稀少颗粒型生长激素细胞腺瘤，对MGMT有局灶性免疫回响(4%)，其余为阴性(96%)。令人诧异的是,在第二组用链霉卵白酶预处理的切片中,生长激素细胞腺瘤显露局部MGMT表达强烈，且有普遍活性(图1)。此外,尚有3例肿瘤,起先为阴性,转为阳性(图2),个中包罗1例40岁的女性的Ki-67标记指数(LI)为30%de1嗜酸干细胞腺瘤,1例60岁的男性Ki-67标记指数(LI)为4%de1泌乳素细胞腺瘤,和1例74岁的男性Ki-67标记指数(LI)为5%的促性腺激素腺瘤。是以，尚有12%的腺瘤在酶的预处理后变为阳性。在Tris/EDTA缓冲液中进行压力蒸煮预处理的第三组切片也获得了雷同的究竟。作为内部对照的内皮细胞呈强阳性(图2a)。Ki-67标记指数和p53与MGMT表达之间无相关性。

图1.a.直策应用MGMT抗体的肢端肥大症患者的稀少颗粒型生长激素细胞腺瘤。请注重局灶性核免疫回响性(×25)。b.沟通的肿瘤，显露使用链霉卵白酶(pronase）预处理后MGMT强而普遍的免疫回响阳性(×25)。

图2.a.嗜酸干细胞腺瘤，最初对MGMT呈免疫阴性。只有内皮细胞有选择性的MGMT免疫回响性，作为内部阳性对照，确认手艺的正确性(×20)。b.统一个肿瘤应用抗原修复方案酿成免疫阳性。注重有局部核MGMT的表达(×20)。

商议

本研究的究竟凸起了应用适当的免疫组织化学手艺，以达到靠得住地识别或者对TMZ治疗有回响的进袭性垂体腺瘤患者的意义。

临床大夫使用的术语“进袭性肿瘤（aggressivetumors）”指的是对外科手术、药物和放射治疗有抗击性的，侵袭性（invasive）和频仍复发的垂体腺瘤和垂体癌。在先前出书的世界卫生组织（WHO）分类中假定这些肿瘤的子集属于“不典型腺瘤”，在组织学上凭据Ki-67标记指数大于3%，伴有普遍的p53核免疫染色来界说。然而，间或注重到不典型腺瘤与肿瘤进袭性之间缺乏相关性。尽管有十多年的集中研究，这一标记物的预后意义不克被证实。此外，对在进袭性肿瘤中的p53状况的寄义仍存有疑问。尤其是，p53突变非常罕有，稀奇是可在垂体癌中发现。是以,仍然不确定p53是否是自力的预后身分。然而，肿瘤的高增殖率，在概念上与肿瘤生长有关，平日与Ki-67升高相关。

因为有普遍的临床行为谱，尽管一些不典型腺瘤引起显著的并发症发生率，比来修订了术语。垂体腺瘤的世界卫生组织（WHO）新版中包罗更新的术语和分类。考虑到Ki-67和p53的展望意义从未被确定，不介绍将这些标记物用于常规诊断。然而，Ki-67与其他参数(例如经由MRI和/或术中视察评估侵袭性)一路使用能够用来评价个别腺瘤或者更具有的临床进袭性性。凭据WHO第4版s所作的改变，“不典型腺瘤”的分类已被镌汰，而引入了“高风险的（high-risk）”腺瘤。“高风险”腺瘤包罗特定类型，指示意为生长快速、放射影像学上具有侵袭性(invasion)、高复发率和对常规治疗有抗击性。这个中包罗以下类型:稀少粒型生长激素细胞腺瘤，男性泌乳素细胞腺瘤，静默性Crooke细胞腺瘤，促肾上腺皮质激素细胞腺瘤和Pit-1阳性的多激素腺瘤，以前称为静默亚型3。比来的研究表明，若是常规治疗不克掌握，稀少颗粒型生长激素细胞腺瘤呈阴性或低的MGMT表达，使用TMZ能成功治疗。此外，TMZ也有或者用于治疗高进袭性和耐药的泌乳素细胞腺瘤和垂体癌。然而,一些患者或者对TMZ治疗发生耐药性

临床病理的争议

固然有一部门示意对MGMT低表达或表达阴性的腺瘤没有治疗回响，MGMT表达的免疫组化评价代表着选择适合接管替莫唑胺治疗的进袭性腺瘤患者的金尺度。没有或低的MGMT的免疫回响机能展望TMZ治疗的回响性。然而，有些病人没有回响。这或者是因为假性低表达或假阴性的MGMT免疫组化的究竟，归因于手艺问题。因为MGMT的表达纷歧致，考虑到缺乏其他可用的治疗体式，有些临床大夫忽略MGMT状况，基于高Ki-67标记指数（LI）或p53强表达，起头使用TMZ治疗。然而，高Ki-67标记指数或p53普遍表达并不总能展望TMZ治疗的回响。凭据一些报道，MGMT免疫组化的发现与Ki-67和p53比拟，并不显露与TMZ疗效有显著相关。此外,TMZ对部门甚至显露极低的Ki-67标记指数的进袭性肿瘤患者有效。这归因于离别使用多巴胺感动剂或生长抑素雷同物治疗泌乳素细胞腺瘤和生长激素细胞腺瘤等药物治疗的或者的结果。上述药物给药后会按捺细胞增殖，从而降低Ki-67水平。

手艺方面的瑕玷

尽管有大量的研究使用MGMT作为标记物使用TMZ治疗患者，但问题在于它是否代表着对TMZ治疗有回响的最佳展望指标仍然是个争执的主题。尽管有针对MGMT特异性抗体，适用于福尔马林固定的，石蜡包埋的组织，可用于免疫组织化学搜检，有几个问题需要引起注重。缺乏MGMT与TMZ治疗回响之间的相关性研究仍存有争议，以前从未获得最终说明。在我们的材估中，MGMT免疫组织化学直策应用，不使用任何修复方案，仅显露1例腺瘤阳性(4%)。然而,应用修复方案后，又获得此外3例最初为阴性转为阳性(共占16%)，而21例(84%)仍然是真正的阴性。这4倍增加的MGMT免疫回响意味着手艺上的缺陷导致假阴性的究竟。应值得注重的是，嗜酸干细胞腺瘤（theacidophilstemcelladenoma）是一个经典的进袭性高风险肿瘤，Ki-67为30%，是本研究系列中标记指数最高的，在应用抗原修复方案后转为阳性。这个范例能够注释部门进袭性肿瘤患者使用TMZ治疗结果欠安。

固然甲醛（formaldehyde）被普遍用于组织固定，它或者会导致免疫组化应用中的手艺问题。为了战胜甲醛造成的抗原隐藏位点（hiddenantigensites）问题，今朝存在几种预处理手艺。尽管如斯,抗体的稀释最佳把持应是由最终用户决意。此外,不得当的组织固定，包罗延迟或耽误腺瘤组织标本在甲醛中的固定以及保留在石蜡组织块的刻日也会影响手艺失效。其他问题则意味着抗体的或所使用的检测系统的敏感性较低。此外,缺乏尺度的评分系统或半定量的MGMT阳性核的计数以及视察者间或视察者内的变异会引起确定MGMT表达的正确水平的难题。大多数作者认为显露MGMT表达阴性或低表达的腺瘤患者是TMZ治疗的适宜治疗对象，然而，其他人认为计数低于20%的MGMT百分比可作为治疗起头的展望身分。以上提到的剖析前和剖析后的问题使一些介绍MGMT免疫组化检测而且只依靠升高的Ki-67的临床大夫感应沮丧。

在此，我们提出了MGMT免疫组织化学或者会导致假阳性究竟的瑕玷。我们的研究究竟说明了所涉及的手艺问题，试图注释在一些最初示意为MGMT阴性或低表达的腺瘤患者，对使用TMZ治疗或者缺乏回响，但或者经由使用抗原修复方案和谈转为阳性表达。

我们的结论是，对于正确选择的要接管TMZ治疗的患者，强烈建议使用得当的抗原修复方案经由免疫组化评估MGMT表达。