Cell：抗生素驱动的肠道微生物群紊乱改变了人体对疫苗的免疫反应

原创yuan微生态2019-09-25

导读

新的证据表明微生物群在免疫中起着焦点感化。然而，人类试验中这种因果的证据很少。本研究对季候性流感疫苗接种前后的健康成年人使用广谱抗生素。究竟显露尽管肠道细菌负荷削减了1万倍，细菌多样性也历久削减，但抗体回响没有受到显著影响。然而在第二次对预先抗体滴度较低的受试者的试验中，抗生素使用对H1N1特异性中和IgG1和IgA连系回响方面存在显著损害。此外，在两项研究中，抗生素治疗均导致(1)炎症旌旗增加(包罗AP-1/NR4A表达)，（以前在老年人中视察到）以及树突状细胞活化增加；(2)代谢轨迹发生差别，以及血清次级胆汁酸削减1000倍，这与AP-1/NR4A旌旗通路和炎症小体激活高度相关。多组学整合揭示了细菌种类和代谢表型之间的主要关联，强调了微生物组在调节人类免疫中的要害感化。 （自媒体久久自媒体）

论文ID （原创文章www.jj00.com）

原名：Antibiotics-DrivenGutMicrobiomePerturbationAltersImmunitytoVaccinesinHumans

（原创文章久久自媒体）

译名：抗生素驱动的肠道微生物群杂乱改变了人体对疫苗的免疫回响

期刊：Cell

IF：36.216

揭橥时间：2019年9月

通信作者：BaliPulendran

通信作者单元单子：斯坦福大学医学院免疫、移植与传染研究所

实验设计

第一阶段(2015年春季)共纳入22名受试者，随机分为抗生素治疗组(n=11)和对照组(n=11)。第二阶段(2016年春季)共纳入11名受试者，要求在曩昔3个流感季候没有接管IIV，且对疫苗中的三种流感毒株中至少两种的MN效价<320，随机分为抗生素治疗组(n=5)和对照组(n=6)。除一人(无法获得接种前血液样本)外，所有受试者均接种了三价流感疫苗(TIV)。口服抗生素治疗方案包罗硫酸新霉素(天天三次，500毫克)，万古霉素(天天四次，125毫克)和甲硝唑(天天三次，500毫克)，共持续5天（接种疫苗前3天至接种后1天）。离别在前21天、前3天、第0天、第1天、第3天、第7天、第30天、第90天、第180天和第365天采集血样和粪便标本(Fig.1A)。

粪便样本进行微生物群基因提取和16S测序，以及生物活性鞭毛卵白和脂多糖(LPS)定量。新颖血液星散血浆和外周血单核细胞，离别检测微中和回响、疫苗诱导抗体水平宁抗体亲和力（ELISA、Luminex法和外观等离子体共振方式）、转录组、免疫细胞比例（流式细胞术）、代谢组和先天细胞免疫分型。行使MMRN整合转录组学、代谢组学、微生物学和细胞频率信息进行综合剖析。

究竟

1.抗生素的使用导致肠道细菌负荷的大幅降低和细菌多样性的持续转变

为商量人肠道微生物群在接种季候性流感疫苗后形成免疫回响过程中的感化，2014-2015年，研究者共招募了22名18-45岁的健康受试者。随机将个中11名受试者分入5天的广谱抗生素组，包罗口服新霉素、万古霉素和甲硝唑夹杂物，目的是消费胃肠道中的革兰氏阴性菌(新霉素)、革兰氏阳性菌(新霉素和万古霉素)和厌氧菌(甲硝唑)。抗生素治疗时间为接种疫苗前3天至接种后1天。研究者在免疫接种后1年内按期收集生物样本，并测量免疫系统的要害指标(Fig.1A)。

作者首先剖析了对肠道微抗生素生物群的影响。在接种疫苗的当天，抗生素组受试者每克粪便中16SrRNA的拷贝总数削减了103-104倍，拷贝总数是肠道细菌相对雄厚水平的替代指标(Fig.1B)。在接种疫苗后的第1天(使用抗生素的最后一天)，抗生素组的总细菌含量达到最低点，然后在第7天到第30天之间逐渐恢复到基线水平。同样地，作者发现粪便中鞭毛卵白和脂多糖(LPS)浓度也示意出相似的动态转变，即在抗生素给药后的早期显著降低(Fig.1C和Fig.1D)。正如所料，对照组在16SrRNA拷贝数、鞭毛卵白或LPS浓度随时间的转变上没有显露出显着的转变(Fig.1B-1D)。

考虑到细菌总负荷下降严重，起头探究受影响最大的是哪些细菌种类。细菌科水等分析显露，在使用抗生素后的1个月内，微生物群构成和相对品貌都发生了显著转变。抗生素组的第0、1、3天肠道微生物群首要成分为Enterobacteriaceae，尽管个中两小我似乎能够抵制抗生素干扰，微生物群的总体数量和构成并没有显着改变(Fig.1E)，这或者与抗生素的依从性有关。到第7天，一些受试者的Enterobacteriaceae仍然是升高的，尽管这部门受试者所占比例较低。Streptococcaceae在采样早期也对照雄厚，而Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Bacteroidaceae和Veillonellaceae的数量在第0、3天削减。到了第30天，Lachnospiraceae、Enterobacteriaceae和Ruminococcaceae的相对水平仍然受到干扰，但最终在第90天恢复到基线水平(Fig.1E)。

作者还经由样本间β多样性的主坐标剖析(PCoA)量化了总体微生物群构造的差别(Fig.1F)。在第0天(接种疫苗的第一天)，抗生素组与对照组的微生物群构成存在显着差别，而第3天两组之间的差距最大。有趣的是，第180天，两组的微生物构成仍然有很大的差别，这表明抗生素组的微生物构成只恢复了原始的一部门。作者还对照了抗生素组使用抗生素前后的微生物群数量和平均度的α多样性。这两种指标在使用抗生素后都严重受损，个中第3天的OTUs的数量起码(Fig.1G)。值得注重的是，物种雄厚度和生物多样性直到6个月也没有完全恢复，这表明一些奇特的细菌种类将历久消散，这与之前的研究一致。

Fig.1研究概况和抗生素使用对健康成年人肠道微生物群的影响

(A)研究概述。共有22名18-45岁的受试者在第0天接管了三价流感疫苗(TIV)接种。11名受试者随机接管为期5天(接种前3天到接种后1天)的口服广谱抗生素治疗。如图所示，按必然的距离(黑色圆圈)收集样本进行剖析。

(B)每克粪便中细菌16SrRNA的尺度化拷贝数。每一行都对应一个受试者。对照组用蓝色透露，抗生素组用红色透露。每个时间点的中值和分布以箱形图的形式透露。

(C和D)每克粪便中鞭毛卵白(C)和脂多糖(D)的浓度。每条细线代表一个受试者；粗线透露几许平均值。

(E)抗生素组在分歧时间点的科水平细菌相对品貌。每个竖条对应一个受试者。在第1天和第3天，数据离别只包含了11小我中的9人和10人。

(F)行使主坐标剖析(PCoA)方式，对样品之间微生物组的Bray-Curtis距离降维。每个圆圈对应一个受试者。

(G)α多样性估量。“Observed”多样性透露每个样本中OTUs的数量(雄厚度)(左图)。“Shannon”多样性考虑了样本内OTUs的雄厚性和平均性(右图)。在抗生素组中，每个圆圈对应一个受试者。中值和四分位数局限显露在箱形图中。

在较量中，经由Mann-Whitney磨练对照了对照组和抗生素组在特准时间点的差别。采用Wilcoxon配对符号秩磨练对照统一组分歧时间点的差别(G)。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001。

2.抗生素对流感疫苗接种所致抗体回响的影响

接下来，作者研究了TIV接种对肠道微生物群的深远持久的影响是若何影响适应性免疫回响的。首先，作者经由测定微中和(MN)回响滴度来评估接种疫苗个别的血清抗体回响。发现对于疫苗中包含的三种流感毒株，这两组人群在所有时间点的MN滴度都相似，这表明抗生素引起的肠道生态系统杂乱并没有显著改变TIV特异性抗体在体外中和同源疫苗毒株的能力(Fig.2A)。对第30天血清转化率(血清转化率为接种后血清中抗体滴度比接种前升高>4倍的受试者占悉数受试者的比例)的剖析也显露了两组究竟具有可比性(Fig.S2A)。然则，作者注重到血清转化率遍及较低，这或者是因为部门受试者的基线滴度较高所致。

为明确抗生素对疫苗所致抗体回响的无影响是否是因为预先存在对流感病毒的免疫力的原因，1年后我们此外招募了11名在疫苗接种前对2015-2016年所用TIV疫苗中包含的三种疫苗株的MN滴度均≤320，并在前三个流感季候没有接种TIV的受试者。随机选择个中5人接管与第1阶段沟通的抗生素治疗。第2期抗生素组的5名受试者的肠道微生物群显现了与第1期个别相似的微生物雄厚度和多样性下降(Fig.S1A-C)。然则在第2期实验中，，发现抗生素组在接种后第90天和第180天H1N1A/California特异性中和显现非常，而其他两种流感毒株没有视察到任何差别(Fig.2B)。

经由ELISA磨练，第2阶段抗生素组受试者第7天，疫苗诱导的针对H1N1A/California株的IgG1抗体浓度显著降低(Fig.2C，右)。这与第1阶段完全相反，第1阶段IgG1回响的强度没有受到抗生素治疗的强烈影响(Fig.2C，左)。为了确认这一究竟，作者请一个自力实验室使用高通量基于Luminex磨练方式来验证我们的初步发现。这两项自力的测量究竟之间显露出惊人的相关性，Luminex法测定第2阶段抗生素组受试者的H1N1特异性IgG1滴度，发如今接种后第7天和第30天显现显著的损害(Fig.2D和2E)，从而证实了之前的究竟。与ELISA数据一致，Luminex法检测1期抗生素组受试者IgG1差别不显著(数据未显露)。主要的是，因为使用抗生素，H1N1A/California株的抗体亲和力也发生了改变(Fig.2F)。

抗生素治疗对疫苗引起的抗体回响的显著影响并不局限于IgG1。行使外观等离子体共振(SPR)方式检测，作者发现了2期抗生素组接种前后的H1N1特异性IgA抗体回响较低(Fig.2G)。Luminex法再次证实了2期这一差别(Fig.2H和2I)，而在第1期抗生素组未见到IgA抗体差别(Fig.S2D)。

Fig2抗生素治疗对TIV体液回响的影响

(A和B)第1期(A)和第2期(B)受试者对TIV疫苗中包含的3种流感毒株的MN滴度。几许平均值用粗线透露，几许SDs用暗影透露。

(C)ELISA检测第1期(左)和第2期(右)受试者的与A/CaliforniaH1连系的IgG1水平。小提琴图显露了样天职布。每个圆圈代表一个零丁的受试者，中位数用粗线透露。

(D)高通量Luminex法测定第2期受试者A/CaliforniaH1的血凝素(HA)特异性IgG1的相对浓度。小提琴图显露了样天职布。每个圆圈代表一个零丁的受试者，而中位数用粗线透露。

(E)ELISA和Luminex法离别测定的第0、7和30天的A/CaliforniaH1的HA特异性IgG1散点图。每个点代表一个受试者。

(F)用外观等离子体共振(SPR)法测量以秒为单元单子的超率，以评估抗体对A/CaliforniaH1的亲和力。数据透露为在基线上的来去转换和倍数转变。每一行代表一个受试者。

(G)SPR测量A/CaliforniaH1的HA特异性IgA亚型连系能力，并透露为第2期受试者的最大共振单元(maxRU)。小提琴图显露了样天职布。每个圆圈代表一个零丁的受试者，而中位数用粗线透露。

(H)Luminex法测定第2期A/CaliforniaH1的HA特异性IgA1的相对浓度。每个圆圈代表一个零丁的受试者，而中位数用粗线透露。

(I)第0天和第30天，SPR测定的A/CaliforniaH1的HA特异性IgA亚型连系能力与Luminex测定的A/CaliforniaH1的HA特异性IgA1的散点图。每个点代表一个受试者。

在较量中，经由Mann-Whitney磨练对照了对照组和抗生素治疗组在特准时间点的差别(A-D,F-H)。采用Wilcoxon配对符号秩磨练对照统一组分歧时间点的差别(F)。(E)和(I)采用Pearson相关。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001。

3.抗生素对疫苗诱导的血液转录回响的影响

为了评估抗生素使用对疫苗诱导的转录回响的量级和动态转变的潜在影响，作者确定了接种疫苗后第1、3、7天(相对于第0天)分歧队列中差别表达的基因数量(Fig.3A)。两组回响的动态转变是沟通的：疫苗诱导的基因表达转变在第1天达到岑岭，然后在第3世界降，第7天第二次增加。与抗生素组比拟，对照组在所有时间点上的差别表达基因都有适度的增加，这或者是因为受试者的数量略高(17人对15人)。

然后，作者进行了基因集富集剖析(GSEA)，以确定两组中响应TIV的转录通路(Fig.3B)。为此，作者使用了一组血液转录模块(BTMs)，这些模块是作者团队经由大规模收集整合了今朝公开可用的人类血液转录组数据集发现的。对照组和接管抗生素治疗的受试者示意出非常相似的富集模式。第一天，与先天免疫回响相关的模块的富集，包罗树突状细胞活化、抗原呈递和干扰素旌旗。第7天，适应性回响的特征显现，细胞周期和浆细胞相关模块的富集反映了浆母细胞的增加。这些视察究竟与作者在剖析前几个流感季候的健康成人疫苗接种者时确定的激活途径一致。进一步研究了这些典型流感疫苗回响通路中涉及的单个基因的时间分布，发现抗生素使用对干扰素旌旗转导(Fig.3C)或浆细胞和免疫球卵白表达(Fig.3D)的动力学或基因表达量没有影响。总的来说，这些发现表明抗生素治疗对流感疫苗的转录回响几乎没有影响。

Fig3对照组和抗生素组受试者对TIV的转录回响

(A)与第0天比拟，接种后第1、3和7天对照组和抗生素组受试者差别表达的基因数量(log2倍改变>0.2,t磨练p<0.01)。

(B)接种疫苗后，对照组和抗生素组受试者BTMs显着富集(FDR<0.05，尺度化富集评分[NES]≥2)。GSEA使用基因列表排序来识别BTMs的阳性(红色)或阴性(绿色)富集，个中基因凭据接种后相对于第0天的倍数转变的t统计量排序。

(C和D)M127(C)和M156.1(D)模块内基因在抗生素治疗组(红色)和对照组(蓝色)中的时间表达模式。黑线透露所有基因的平均倍数转变。

4.抗生素导致血液中促炎性转录和细胞回响

接下来，作者研究了零丁使用抗生素是否能引起血液转录组的转变。匹敌生素受试者从筛选（前21天）到第0天之间基因表达转变进行了GSEA剖析(Fig.4A)。究竟发如今使用抗生素后，大量基因模块的表达发生了转变，包罗炎症旌旗的增加和树突状细胞的激活，以及B细胞和细胞周期相关表达的削减。经由流式细胞术测量了几种非特异性免疫细胞的比例，视察到使用抗生素后，CD80+CD16+髓样树突状细胞(mDCs)和CD123+浆细胞样树突状细胞(pDCs)的显著增加(Fig.4B)。这些转变与基因表达检测到的树突状细胞活化富集一致(Fig.4A)。抗生素组受试者的这部门细胞数量在整个抗生素治疗过程中(第0天和第1天)都有所增加，而且在住手使用抗生素后起头恢复到可控水平，这进一步表明，这些转变是由抗生素引起的肠道微生物群杂乱造成的。

被抗生素激活的通路中，有几个与AP-1(FOS/JUN)和Nur(NR4A)转录因子相关的模块尤其令人感乐趣(Fig.4C和4D)。抗生素组受试者在接种疫苗后的第1天，这些模块仍然处于较高水平，而在接种疫苗后的对照组中，这些模块处于较低水平(Fig.4C)。令人诧异的是，看成者将这些模块的动力学与2010-2011年流感季候接种疫苗的年青年头人和老年人的模块进行对照时(离别为淡蓝色和栗色条形图)，能够视察到，年青年头受试者与对照组相似（第一天这些模块表达下降）；而抗生素组受试者与老年接种者相似（这些通路在接种疫苗后上调）。这些模块还包罗一些使用抗生素后诱导的促炎细胞因子的基因，包罗IL6、IL8和CXCL2(Fig.4D)。为了进一步索求AP-1和NR4A在调节这些转录回响中的潜在感化，作者在TRANSFAC数据库或经由文献检索确定了这些转录因子的潜在靶基因。在第1天视察到这些转录因子和它们各自的靶基因之间有很强的相关性(Fig.4E)。这些究竟表明，抗生素驱动的肠道微生物群损耗或者驱动非特异性免疫细胞的炎症旌旗，其体式与岁数相关的免疫回响转变一致。

Fig.4抗生素使用后的转录组和细胞的应答

(A)抗生素使用后BTMs显着增加(FDR<0.05)。GSEA被用来较量使用排序基因列表的BTMs的尺度化富集得分(NES)，按照使用抗生素的受试者第0天和筛选(前21天)的基因倍率转变的t磨练值排序。强化的模块凭据其高级功能注释着色。

(B)使用抗生素和接种疫苗后树突状细胞亚群的动力学。实线透露平均倍率转变，暗影区域透露95%置信区间。

(C)使用抗生素和接种疫苗后AP-1/NR4A相关BTMs的动力学。实线代表抗生素治疗组(红色)和对照组(蓝色)的平均模块表达，条形图透露2010-2011年流感季候接种TIV的年青年头人(<65岁，淡蓝色)和老年人(≥65岁，栗色)的平均模块表达。误差条透露SEM。

(D)AP-1/NR4A相关BTMs基因。每条“线”(灰色线)透露一个共表达关系，颜色透露第0天和筛选(前21天)比拟的log2倍数表达(正向-红，负向-绿)。

(E)第1天AP-1/NR4A靶基因与响应转录因子的Spearman相关性。AP-1采用FOS/JUN的平均表达量，NR4A家眷采用NR4A1/2/3/3的平均表达量较量相关关系。

在较量中，经由Student’st磨练对照掌握组和抗生素治疗组在特准时间点的差别。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001。

5.抗生素会骚动血液代谢组

众所周知，肠道微生物群在各类营养物质的代谢过程中施展着主要感化，包罗消化复杂碳水化合物和合成维生素。是以，作者试图经由非靶向高差别率代谢组学检测使用抗生素后受试者血液代谢组学的转变。相对于对照组，抗生素组受试者的代谢组的确显现了较大的波动，这是经由较量筛选（前21天）和第0天两个时间点之间最可变代谢物特征的欧氏距离来权衡的(Fig.5A)。行使mummichog软件对差别特征进行富集剖析，发现抗生素能够引起多种途径的转变，包罗胆汁酸代谢和色氨酸代谢(Fig.5B)。这与已知的肠道微生物群在调节胆汁酸池以及掌握色氨酸对吲哚、基嘌呤和血清素的代谢途径的功能一致。因为非靶向方式无法靠得住地识别特定代谢物，作者使用经由验证的化学尺度进行了自力的液相色谱-质谱剖析，以进一步明确抗生素治疗后单个胆汁酸的转变。因为微生物群负责将肝脏合成的初级胆汁酸转化为肠道中的次级胆汁酸，作者估计在抗生素治疗后，初级胆汁酸与次级胆汁酸之比将会增加。切实，抗生素组受试者血清中初级胆汁酸水平升高、次级胆汁酸水平降低(Fig.5C)。

接下来，作者研究了肠道微生物群消费对流感疫苗后的代谢回响的影响。在对照组中，对疫苗接种回响的代谢转变在第1天达到岑岭(Fig.5D)。抗生素组在第一天也有雷同水平的回响；然则，他们的代谢物组转变远远跨越了对照组，并在接种疫苗后的第7天仍然示意出与第0天比拟相当大的差别。看成者搜检接种疫苗后增加了的代谢途径时，发现两组之间增加的代谢途径几乎没有重叠(Fig.5E)。是以，抗生素的确显著改变了血液中流感疫苗接种后的代谢回响。

为了进一步商量代谢回响的差别，作者对两组存在品貌差别的代谢物峰在分歧时间点的倍数转变值(p<0.01)进行主成分剖析(PCA)。与对照组比拟，抗生素组受试者在接种疫苗前后的代谢轨迹都发生了深刻的转变(Fig.5F)。主要的是，两名抗生素治疗的受试者的轨迹与对照组沟通，他们的微生物群几乎没有转变(Fig1)，这表明他们匹敌生素方案的依从性较差。

Fig.5抗生素和流感疫苗对血液代谢组的影响

(A)对照组(蓝色)和抗生素组(红色)第0天和筛选(前21天)的最多变(所有时间点间变异系数>8%)代谢物特征的欧氏距离。误差条透露SEM。

(B)抗生素使用子女谢通路显着雄厚。Mummichog软件被用来确定抗生素组受试者第0天与筛选(前21天)时间点间基于表达差别代谢物特征(p<0.05，Student’st磨练)的强化通路(p<0.05，置换磨练)。

(C)相对于筛选(前21天)，第0-7天接管抗生素治疗受试者的初级和次级胆汁酸的倍数转变。

(D)相对于第0天，接种疫苗后第1-7天对照组和抗生素组受试者之间最可变(所有时间点间变异系数>8%)代谢物特征的欧氏距离。误差条透露SEM。

(E)对照组受试者和接管抗生素治疗受试者接种流感疫苗后，代谢通路显著增加(p<0.05)。

(F)相对于筛选时间(前21天)，第0-7天对照组和抗生素组受试者前两种首要成分的代谢轨迹。这里代谢轨迹是指在研究过程中(0-7天)，凭据在主成分空间中投射的所有分歧代谢物特征的品貌转变(p<0.01)的每个受试者的代谢轨迹。

在较量中，经由Student’st磨练对照掌握组和抗生素治疗组在特准时间点的差别。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001。

6.抗生素组受试者的次级胆汁酸杂乱与NLRP3炎症小体旌旗转导升高有关

考虑到肠内微生物群的损失严重改变了血浆代谢组，作者进展索求这种代谢杂乱与视察到的抗生素治疗后细胞和转录转变之间的潜在关联(Fig.4)。在抗生素组受试者中，胆汁酸代谢发生了显著改变，这种代谢杂乱与炎症性肠病(IBDs)有关，并或者在这种情形下施展免疫调节感化。事实上，对转录组和代谢组学数据的综合剖析显露，单个次级胆汁酸水平与图4中所示的很多炎症性BTMs呈显著的负相关，这些BTMs是抗生素治疗后诱导发生的(Fig.6A)。抗生素治疗后，血浆中石胆酸(LCA)削减了1000倍(Fig.6E)。LCA与炎症回响的相关性最强，包罗介入AP-1旌旗传导的模块(如M35.0)；M35.0在抗生素组受试者疫苗接种后上调(Fig.6C)，而在对照组接种后下调(Fig.6D)。LCA是胆汁酸受体TGR5最有效的感动剂，TGR5旌旗已被证实能够按捺小鼠NLRP3炎症小体的激活。此外，AP-1在IL–1B介导的促炎细胞因子(如IL-6)诱导中施展主要感化。是以，作者还研究了炎性小体和IL-1B旌旗通路相关基因的表达转变，并发现了其与LCA和其他次级胆汁酸的亲切关联(Fig.6A和6B)。这些发现强调了一种潜在的机制，微生物群能够经由这种机制调节人类的炎症回响。

Fig.6抗生素组受试者次级胆汁酸杂乱与NLRP3炎症小体旌旗转导升高有关

(A)Circos图显露了抗生素组和对照组相对于筛查时间(前21天)，第0-7天继发性胆汁酸、抗生素诱导的BTMs(Fig4A)和炎性小体旌旗基因的log2倍转变。直线透露显著相关(p<0.01，所有时间点的Pearson相关)。

(B)FOSB表达随血浆中LCA倍数转变的散点图(各时间点)。每个点代表一个受试者。

(C和D)抗生素组(C)和对照组(D)中，M35.0基因的倍数转变。每一个“线”(灰色线)透露共表达式关系;颜色代表第一天与筛查时间(前21天)的log2倍转变(正向,..;负向,蓝色)。

(E)抗生素组(红色)和对照组(蓝色)血浆中LCA的转变。每条细线代表一个受试者;粗线透露几许平均值。

7.MMRN剖析表明肠道微生物群经由分歧的途径调节炎症旌旗传导和抗体对疫苗的应答

肠道微生物群能够经由将微生物刺激物易位到体腔内直接影响免疫回响，也能够经由次生信使(如代谢物)间接影响免疫回响。是以，作者测量了血清中鞭毛卵白和抗LPS抗体的浓度(Fig.S1D-F)，但在对照组和抗生素组间没有发现任何差别，这辩驳了微生物刺激物向体腔内转移的假设。为商量假设中的间接影响，作者构建了一个多标准、多身分的回响收集(MMRN)，它综合了转录、代谢、微生物和细胞剖析，以确定抗生素使用和流感疫苗接种时代这些数据类型之间的关系。在该收集中，细菌-代谢物关系占主导地位(Fig.7A)，显露了肠道微生物群对宿主代谢的塑造能力。

接下来，为确定与视察到的胆汁酸代谢和H1N1特异性IgG1响应的差别最相关的收集节点，作者经由一种基于富集的方式对该收集进行了查询，使用的特征是凭据其第0天与筛选时间的倍数转变的相关性进行排序，这些转变要么与抗生素导致的LCA转变有关，要么与第30天H1N1特异性IgG1品貌有关(Fig.7B)。与作者之前的剖析一致，LCA降低和转录簇G3增加之间存在显著负相关，转录簇G3包含很多介入炎症回响、树突状细胞活化和AP-1旌旗的BTMs。此外，LCA还与富含胆汁酸生物合成的代谢物簇M79亲切相关，这表明非靶向代谢组学剖析可以正确地捕获到微生物群杂乱所改变的代谢通路。

尽管在抗生素组受试者的胆汁酸代谢和IgG1回响都受到了干扰，但与LCA和H1N1特异性IgG1品貌都相关的代谢和转录簇几乎是没有重叠的。只有富含雄激素和雌激素代谢的代谢产品簇M84与这两个参数都负相关。与这种低重叠一致，IgG1滴度与胆汁酸品貌转变呈弱相关。相反地，遍及相关的特征都是由细菌主导的，有三个细菌簇与这两个参数都呈正相关。对这些细菌簇的构成剖析表明，Lachnospiraceae和Ruminococcaceae科成员的比例很高(Fig.7C)，并均在抗生素治疗后显著降低(Fig.7D)。有趣的是，在与IgG1回响零丁相关的集群中，有两个富含脂肪酸代谢的集群(M26和M58)，这两个集群正逐渐成为免疫功能的要害调控因子。

细菌群在收集中的中心感化促使研究者进一步研究肠道细菌含量对这两种途径的主要性。事实上，LCA的转变与抗生素治疗后的粪便中的细菌负荷、鞭毛卵白和LPS含量亲切相关(Fig7D)，H1N1特异性IgG1品貌也与中鞭毛卵白的削减显著相关(Fig7E)。有趣的是，鞭毛卵白和IgG1效价之间的这种正相关只在基线效价较低的2期受试者中显著，这凸起了免疫记忆对严重失调的恢复能力。综上所述，这些究竟表明，次级胆汁酸相关的炎症旌旗和流感疫苗IgG1应答受损是由抗生素驱动的肠道要害菌群丢失所介导的自力效应。

Fig.7MMRN剖析表明，肠道微生物群在调节炎症旌旗和H1N1特异性IgG1方面具有奇特的功能回响

(A)MMRN中包含的分歧数据类型之间p值的分布。

(B)第0天vs筛选，MMRN保持中的可视化收集子集，包含与LCA或H1N1特异性IgG1相关的节点。每个节点都是来自一个数据类型的特征集群。经由偏最小二乘回来和置换磨练的显著相关(FDR<0.05)竖立节点间的关联(灰色)。经由基于富集的方式对收集中抗生素诱导的节点转变(第0天vs筛选)和LCA(第0天vs筛选)与H1G1特异性IgG1(第0天vs第30天)的关系进行查询，以确定积极(红色)或消极(绿色)关系(FDR<0.05;NES>2.6)。

(C)饼状图显露了细菌群B0、B1和B4中的OTUs目成员。

(D)第0天vs筛查，血浆LCA水平与细菌负荷(16SrRNAqPCR检测)、LPS，鞭毛卵白的倍数转变的散点图。每个点代表一个受试者。

(E)粪便鞭毛卵白品貌的第0天与筛选间转变倍数离别与第7天和第30天HIN1特异性IgG1的散点图。每个点代表一个受试者。

商议

经由在两个具有分歧中和性抗体基线水平的自力队列中进行这项试验，研究者可以深入认识预先存在的体液免疫对微生物群介导的疫苗接种适应性回响转变的影响。基线滴度高的受试者抗生素对疫苗所致抗体回响的影响最小，但在基线滴度低的第二期受试者中，作者视察到接种疫苗后，抗生素治疗对H1N1特异性IgG1的数量有显著影响。值得注重的是，这种结果只在对H1N1的回响中视察到，并没有在其他菌株中显现。其原因今朝尚不清楚，但成人接种疫苗后H3N2和B抗体的回响或者首要是依靠回忆性记忆回响。比来的研究表明，因为之前接种疫苗或传染，成年人的H3N2和B亚型记忆水平较高。

这些究竟为研究者之前在小鼠模型的发现供应了主要的配景：在小鼠中，经由敲除TLR5或使用抗生素，TLR5介导的鞭毛卵白传感缺失导致流感疫苗接种后抗体滴度显著降低。实验小鼠对流感病毒的应答是首次的，而实际上所有人都曾接触过流感，并且与最初的回响比拟，涉及回忆回响的机制或者对肠道微生物群的转变更具恢复力。这些究竟凸起了人类免疫系统的真正适应性，它似乎可以在很大水平上连结对刺激或挑战的适当回响，尽管因为微生物群波动而引起了显著的生理失调。这也强调了在形成免疫系统中免疫记忆和情况的主要性。以往的研究表明，人群内的免疫变异首要是由情况身分(如先前的免疫露出)而不是遗传身分驱动的。本研究的究竟与成年人免疫回响的概念一致，即免疫回响首要由免疫史决意，而且对微生物群的短暂转变具有弹性。然而，在将来将这类剖析扩展到婴儿群体将是极其主要的。在婴儿群体中，免疫系统的不成熟状况或者更轻易受到这种干扰，而不受免疫印迹的影响。有关自身免疫性疾病(如哮喘和1型糖尿病)与临蓐方式相关的肠道微生物差别的报道已经证实了这一点。

关于先天免疫回响，作者视察到仅使用抗生素就能在免疫系统内引起显著的细胞和转录转变，促进促炎状况。综合剖析显露，这些炎症回响与细菌介导的次级胆汁酸生成削减亲切相关。次级胆汁酸(如LCA)除了经由TGR5按捺NLRP3炎性小体，还经由与维生素D受体和孕烷X受体连系按捺促炎细胞因子的发生和核因子kB(NF-kB)靶卵白的表达。综上所述，这些究竟表明抗生素治疗后在外周血中检测到的炎症回响是由肠道菌群对胆汁酸代谢损坏导致的炎症小体增加所驱动的。

有趣的是，抗生素引起的促炎状况与老年人对流感疫苗的早期转录回响相似。已知微生物组的构成随岁数而转变，示意为厚壁菌门和整体多样性削减。与岁数相关的微生物群转变对胆酸代谢的影响尚未获得很好的证实，但有证据表明老年受试者的肠道微生物群发生其他免疫调节代谢产品的能力较低，如短链脂肪酸。小鼠实验显露这些上调的通路(AP-1和NR4A旌旗)也被认为是由细菌LPS触发的，而且肠道通透性会跟着岁数的增进而增加。进一步研究肠道微生物群影响老年人免疫系统的直接和间接机制，将有助于认识微生物群中与岁数相关的转变若何有助于慢性炎症和免疫衰老。

最后，研究者构建了一个MMRN，它综合了多种数据类型匹敌生素治疗和流感疫苗接种的回响。研究究竟表明，微生物组是经由其他的机制调节胆汁酸代谢及其对炎症的影响，而欠亨过影响抗体回响。有趣的是，IgG1回响与脂肪酸代谢高度富集的两个代谢簇显著相关，而脂肪酸代谢是免疫回响的主要调控因子。这些究竟强调了微生物群对免疫功能施展多种感化的能力，不光是经由与肠道内的免疫细胞直接互相感化，还经由如调节要害代谢物的系统可用性等间接机制。

在此，作者已经证实了由抗生素驱动的微生物群波动或者影响健康成年人对疫苗的免疫回响。因为抗生素和疫苗是最普遍使用的两种医疗干涉手段，这对临床实践和民众卫生具有主要意义。这些发现将为进一步的研究供应信息，以更好地舆解肠道微生物群和免疫系统之间互相感化的机制。